Estudio cientifico.Alain Vian

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Acumulación sistémica de la cremallera de leucina* básica de transcripción del ARN mensajero después de una estimulación de la planta con una onda de 900 Mhz

David Roux, Alain Vian, Pascal Goupil, Sébastien Girard, Pierre Bonnet, Françoise Paladian y Gerard Ledoigt

ERTAC, Equipo de Investigación y de Transducción de la Vigilancia Celular, Universidad Blaise Pascal, Departamento de Biología, Avenida de Landais, 24, 63177 Aubière Cedex, Francia.

Gerard.Ledoigt@univ-bpclermont.fr

LASMEA, Laboratorio de Ciencias de Materiales para la Electrónica y el Automatismo, Universidad Blaise Pascal, Departamento de Física, Avenida de Landais 24, 63177 Aubière Cedex, Francia.

Francia, Paladian@univ-bpclermont.fr

Alain Vian, Alain.VIAN@univ-bpclermont.fr, teléfono (33) 473 407 918, fax: (33) 473 407 942

*La cremallera de leucina está formada por un segmento de aminoácidos rico en leucinas que forman un motivo de dimerización. La dimerización permite la yuxtaposición de las regiones de unión al ADN de cada una de las subunidades. Una cremallera de leucina forma una hélice anfipática en la que las leucinas de la cremallera de una de las proteínas pueden sobresalir de la hélice a y trabarse o engranarse con las leucinas de la cremallera de otra proteína que se encuentra situada de manera paralela para formar un dominio de bobina en espiral (coiled-coil).

De hecho, las dos cremalleras de leucina forman una estructura en forma de Y, en la que las cremalleras forman el tallo y las dos regiones básicas se bifurcan de manera simétrica para formar los brazos que se unen al ADN. Esto es lo que se conoce como el motivo estructural bZIP y explica la razón por la que las secuencias diana de tales proteínas son repeticiones invertidas sin separación. Las cremalleras pueden utilizarse para promover la formación de homodímeros o heterodímeros. Existen cuatro repeticiones de este tipo en la proteína C/EBP (un factor que se une como dímero tanto a la caja CAAT como al intensificador o potenciador del núcleo de SV40), y cinco repeticiones en los factores que forman el factor de transcripción heterodimérico AP1.

Resumen

En este trabajo se demuestra que las ondas en una amplitud de banda de 900 Mhz son un verdadera estímulo ambiental, ya que se produce una inmediata caída (60%) en la cantidad de las cremalleras de leucina básicas (bZIP) del factor de transcripción del RNA mensajero y la transmisión de una señal traumática.

También se muestra que las transcripciones de calmodulina* aumentan después de un período de radiación, lo que posiblemente indica una posible implicación del metabolismo del calcio como respuesta al estimulo de los campos electromagnéticos.

• Calmodulina: La calmodulina (CaM) es una proteína acídica intracelular, de bajo peso molecular y termoestable que se localiza principalmente en el cerebro y el corazón y es expresada en todas las células eucariotas, siendo uno de los reguladores en la transducción de la señal de calcio en la célula. Actúa como receptor para Ca⁺², gracias a que presenta cuatro sitios de unión al ion Ca con una alta afinidad, pero siempre de forma reversible. Ésta se asocia a multitud de proteínas diferentes y en su estado de unido al ion Ca⁺² modula sus actividades, por ejemplo se encarga de regular una gran variedad de enzimas. Fuente: Wikipedia.

Introducción

En la naturaleza las plantas están sometidas continuamente a diversos tipos de estímulos ( viento, agentes patógenos, sequía, luz ultravioleta, lluvia...). Debido a su inmovilidad, ya que no pueden huir, deben adaptarse a estas variaciones del medio y adaptar su desarrollo de acuerdo con ellas. Actualmente, debido a la utilización creciente de los dispositivos inalámbricos de comunicación, se ha producido una aumento en la densidad de las radiaciones electromagnéticas generadas por el hombre en el entorno. Esto genera numerosas preguntas sobre los posibles efectos de estas radiaciones sobre la vida, sobre todo en los seres humanos. Numerosas investigaciones se centran en estos aspectos (1), sobre todo en el margen de frecuencia entre 200-1800 Mhz, que es la frecuencia de emisión de los teléfonos móviles. Debido a problemas médicos, nos propusimos llevar una investigación a través de estudios epidemiológicos (2). Nos propusimos establecer una relación entre el agente causal y los efectos en la población, pero de una forma más formal. Por lo tanto, creamos un diseño experimental estableciendo el énfasis en 3 puntos principales:

1.- Un control total sobre los campos electromagnéticos (frecuencia, amplitud, polarización, duración...) producidos dentro de una cámara con compartimientos revueltos modo único de reverberación con un blindaje metálico (MSRC), lo que garantizaba la protección frente a campos electromagnéticos del medio.

2.- Elección de las plantas (tomate, Lycopersicon esculentum) como modelo biológico inmóvil y sensible.

3.- Un marcador biológico que nos pudiera servir como un indicador de los cambios metabólicos ( es decir, la cantidad de ARN mensajero de estrés relacionado con los genes).

Demostramos previamente que las plantas expuestas a una campo electromagnético generado por una onda de 900 Mhz, 5 V.m durante un período de 1 a 10 minutos mostraba un aumento en el factor de transcripción de la cremallera de leucina básica del ARN mensajero. EL presente informe también se señala, aunque de una forma más débil, un aumento de las transcripciones de calmodulina al someter a la planta al mismo campo electromagnético. También se demuestra que la exposición de una sola hoja a la radiación electromagnética (mientras se protege al resto de la planta) origina las mismas respuestas en los restantes tejidos protegidos, lo que sugiera una transmisión de una rápida señal traumática a toda la planta.

MATERIAL Y MÉTODOS
A. Estimulación EMF
La estimulación EMF se realiza mediante un MSRC que garantiza una homogéneo e isotrópico campo electromagnético a 900 MHz [3]. Las plantas son cultivadas para 3 semanas en un CEM de cámara de cultivo transparente , la cuarta hoja terminal es inmediatamente cosechada después de la estimulación, y congelada en nitrógeno líquido. Para el blindaje de los experimentos, las plantas se colocan en aluminio de 1 mm marca EMF a prueba en un contenedor (que da un factor de atenuación de 23 dB a 900 MHz) con la primera hoja emergente fuera (Fig. 1). Las plantas Control se colocan en el recipiente sin tejidos emergentes , por lo tanto no son expuestas a las radiaciones EMF. ARNm B. cantidad medida
El ARN es aislado utilizando el método reactivo TRI- (Sigma Chemical), se convirtió al cDNA único (Ventaja de RT-PCR, BD Biosciences). Este cDNA se utilizado como una matriz de primer cuantitativas de RT-PCR, y la cantidad de mRNA relativo (Qr) se calcula de acuerdo con el método 2-ΔΔCt [4], relativo a la actina la cantidad de ARN mensajero, y normalizado para el control (No estimulado) de referencia.

Fig. 2. Las variaciones de la calma-N6 y la cantidad de actina mRNA después de
la exposición a CEM de toda la planta crecen bajo condiciones de luz diurna. QR: relative
ARNm de la cantidad. C: plantas totalmente blindado. 0, 5, 15, 30: minutos después del final de estimulación.

Resultados y discusión
La calma-N6 [5], se muestra la cantidad de mRNA de la luz del día un aumento rápido y transitorio después de exposición de la planta a HF-EMF (Fig. 2). Este incremento ocurre inmediatamente después de la estimulación (Fig. 2, carril 0) y un máximo de 15 minutos más tarde (que muestra una típica a 4- 5,5 veces más, la figura. 2, carril 15). Por el contrario, la cantidad de la actina de referencia ARN mensajero se mantiene constante.
Este resultado indica que la calmodulina puede estar implicada en la respuesta de la planta al estímulo HF-EMF , como informó de muchos problemas ambientales [6]. También se sugiere (aunque no demuestra) que el metabolismo del calcio se ve afectado por los campos electromagnéticos. Por lo tanto, es probable que un panel de respuestas celulares (es decir, los movimientos de calcio, modulación de fosforilaciones, de transcripción específicos
factores ...) tendrá lugar rápidamente después del tratamiento EMF. En este contexto, el rápido aumento en el ARNm bZIP (a estrés factor de transcripción relacionados [7]) que recientemente demuestran puede que constituya uno de estos eventos.

Fig. 3. Las variaciones de la cantidad de ARNm LebZIP1 después HF-EMF

la exposición de toda la planta crecen bajo condiciones de oscuridad

En la oscuridad, la estimulación EMF causó una disminución en la cantidad de mRNA relativo. C: plantas totalmente blindado. en la cantidad de ARNm bZIP (Fig. 3). Este resultado sugiere que la luz constituye un parámetro importante de regulación de la respuesta al estímulo de los campos electromagnéticos. resultados similares se observaron en la expresión génica , muchos relacionados con el estrés después de tratamiento de la herida [8,9].

Se produjo una respuestas sistémica general (es decir, en toda la planta) relacionada con el estrés después de un estímulo local.

Para probar si el tratamiento EMF tiene características similares, que configuran el diseño experimental descrito en la figura. 1. la primera hoja es la única parte de la planta expuestos a los CEM tratamiento, mientras que el tejido analizado (hoja terminal 4 º) estan protegidas en el contenedor. Este montaje experimental implica condiciones de oscuridad para las plantas. Aquí, como se observa de experimentos llevados a cabo en la oscuridad, el LebZIP1 la cantidad de ARNm muestra una disminución rápida y transitoria (Fig. 4) máxima (60%) 5 min después del final de la estimulación. El retorno de la cantidad a un nivel casi normal después de30 minutos. Durante este tiempo, no se observa variación de el ARNm de control de actina (datos no mostrados). La planta-control , totalmente protegida en el recipiente (es decir, por lo tanto, no están expuestos a los campos electromagnéticos) no muestran variación significativa en la cantidad de transcripciones bzip o actina (fig. 5).
Los datos presentados aquí indican que los tejidos situados a cierta distancia del lugar de estimulación (por lo tanto no directamente estimulada) responden de manera similar que los tejidos sometidos a las radiaciones EMF. Este resultado implica que

1. la FEM estimulación constituye un verdadero estímulo ambiental que conduce hacia la transmisión de una señal traumática

Fig. 4. Blindaje experimentos. Las variaciones del ARNm LebZIP1
cantidad después de la exposición de una sola hoja (primera hoja expuesta, la terminal de cuarta hoja blindada analizados). QR: la cantidad de mRNA relativo; C: control (es decir, totalmente blindado plantas), 0, 5, 15, 30: minutos después del final de la estimulación.
Ejemplo de experimento de tres experimentos independientes similares.

Fig. 5. Experimentos de blindaje de control. Las variaciones de la LebZIP1 actina y la cantidad de ARNm ± SD en los plantas no expuestos a EMF (la oscuridad condiciones necesarias). QR: la cantidad de mRNA relativo. C: plantas totalmente protegidas.. emitida por el tejido expuesto a toda la planta. Este mensaje se mueve rápidamente a través de la planta a nivel molecular las respuestas se produjeron con la misma cinética en los tejidos expuestos o protegidos . La naturaleza exacta de este mensaje es todavía hipotético, mientras que las obras anteriores han implicado molecular mensajeros (ABA, systemin, oligosacáridos ...) y / o de señales eléctricas (acción potencial y el potencial de variación) en el de larga distancia señalización en las plantas [10,11]. Los experimentos se están llevando para descifrar si esos mecanismos se producen después de la estimulación EMF.

AGRADECIMIENTOS
Los autores desean agradecer al Ministerio francés de Educación e Investigación de la ACI concesión "RTM-0005" otorgado a G. Ledoigt.

Referencias
[1] C. Graham, A. Sastre, Sr. Cook, R. Kavet, MM Gerkovich y
D.W. Rifle, "La exposición a campos magnéticos de FEB fuerte no altera los mecanismos de control autonómico cardíaco ", Bioelectromagnetics, vol. 21, pp 413-421, 2000.
[2] JM Elwood, "Los estudios epidemiológicos de exposición a radiofrecuencia y los cánceres humanos ", Bioelectromagnetics, supl. 6, pp 63-73, 2003.
[3] D. Roux, A. Vian, P. Goupil, G. Ledoigt, S. Girard, F. Paladian, P. Bonnet, "MSRC mediciones de alta frecuencia no ionizante las radiaciones electromagnéticas (NIR) en los organismos vivos ", 16
Simposio Internacional de Zurich sobre compatibilidad electromagnética, en Press, 2004.
[4] K.J. Livak y Schmittgen TD, "Análisis de los genes en relación los datos de expresión utilizando en tiempo real PCR cuantitativa y la ΔΔCt 2 método, los métodos, vol 25, pp 402-408, 2001.
[5]N. Depege,C.Thonat, J. L. Julien,N.Boyer,
"Thigmomporphogenesis: modificación del ARNm de la calmodulina y los niveles de proteína en las plantas de tomate ", J. Plant Physiol., vol 155, pp 561-567,
1999.
[6] L. Xiong, K. S. Schumaker y J.K. Zhu, la señalización celular durante Frío, la sequía y estrés salino, la célula vegetal, S165-S183 (Suplemento) 2002.
[7] B. Stankovic, A. Vian, C. Henry-Vian y Davies E., "Molecular la clonación y caracterización de un ADNc que codifica una forma sistémica de tomate heridas incucible bzip-proteína de unión a ADN, Planta, vol 212, pp 60-66, 2000.
[8] B. Stankovic y Davies E., "Los dos potenciales de acción y de la variación potencial inhibidor de proteínas inducen la expresión de genes en tomate ", FEBS
Lett, vol 390, pp 275-279, 1996.
[9] A. Vian, C. Henry-Vian y E. Davies. "Rápido y sistémica la acumulación de las transcripciones de ARNm de unión a proteínas del cloroplasto después estímulo llama en el tomate ", Planta. Physiol., vol 121, pp 517-524, 1999.
[10] Graham, JS, Hall, G. Pearce, G. y Ryan, CA , "Reglamento de síntesis de inhibidores de la proteasa I y II mRNA en las hojas de los heridos plantas de tomate ", Planta, vol 169, pp 399 405, de 1986.
[11] B. Stankovic y E Davies, "la comunicación en Intrercellular plantas: la estimulación eléctrica de la expresión del gen inhibidor de la proteasa en tomate ", Planta, vol 202, pp 402-406, 1997.

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